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シーケンス結果を用いて投稿予定ですが必要な情報を教えてください。
• Sequencing Kit : ABI BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits
• Sequencer : ABI 3730xl Analyzer (96 capillary type)
• PCR machine : BioRad DNA Engine Dyad PTC-220
• Seuencing protocol；
Sequencing reactions were performed in a BioRad DNA Engine Dyad PTC-220 Peltier Thermal Cycler using the BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo Fisher Scientific), according to manufacturer's instructions. Single-pass sequencing was performed on each template using [universal or your own] primers. The fluorescent-labeled fragments were purified from the unincorporated terminators either by ethanol precipitation method or using the BigDye XTerminator™ Purification Kit(Thermo Fisher Scientific). The samples were analysed by a 3730xl DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific).
解析結果グラフにあるPhred Scoreとは何ですか？
Phredとは、
Base callingプログラムであり、シーケンサが作り出したイメージファイル(ABI, SCF, ESDなど)を読み込み、Fasta formatに変換するプログラムです。グラフイメージ中のchromatogramの曲線を見て適切なBaseを指定するとともにスコアまで作りファイルにし、Fourier Transform Algorithmが使用されます。
Phredから得られたスコアをQV (Quality Value)にて塩基配列の正確さを判定することができるようにQVを割り当てております。 QVを単純に「Phred Score」とも呼ばれます。
QV = -10 * log (P)
Phred Scoreが20の塩基配列のエラー確率は10-2（正確度99％）
Phred Scoreが30の塩基配列のエラー確率は10-3（正確度99.9％）
Phred Scoreが40の塩基配列のエラー確率は10-4（正確度99.99％）
サンプルおよび解析結果の保存期間は？
お送りいただいたサンプルは、弊社到着から1ヶ月間保管いたします。オーダー様式でサンプル保存の【希望しない】を選択された場合には、サービス終了後に処分いたします。
解析データは弊社のサーバーに1ヶ月間保存いたしますので、その間に必ずデータの保存をお願いいたします。
プライマーはどのように準備して送ればいいのでしょうか？
サンプル試料と混合せず、必ず別の1.5mlチューブにご用意ください。
5 pmol/ul に調整した溶液を基本量10ulに、追加1反応につき2ulを足した量をお送りください。弊社にてプライマーの濃度確認が行えないため、プライマーの濃度が正確でない場合、良好な結果が得られない可能性が御座います。必ずプライマーの濃度をご記入くださいますようお願い申し上げます。
シーケンシング用のプライマーはPAGEおよびHPLC精製以上の品質がお勧めですが、OPC精製においても同様の水準のqualityが保障されるのであれば問題ありません。GC contentは40-60％程度、dimer formationおよびhair-pin formationが4bp以上にならないよう、また、end stabilityが高くないようにデザインしてください。50℃(単一条件下)でannealingするため、Tmは50-58℃をお勧めします。
弊社保有のユニバーサルプライマーをご利用の際は、必ずプライマーの配列をご確認の上、ご選択ください。稀なケースですが、いくつかのベクターにて、ベクターマップに該当する配列があるにも関わらず、結合しない場合が御座います。（ex. PET, pCL, pENTR, pDONR etc.）
DNAはどのように準備した方がいいですか？
Plasmid DNA (high copy number) は100-200ng/ul、PCR産物は50-100ng/ul手移動の濃度で1.5mlチューブにご用意ください。ご依頼の反応数に応じて、基本量10ulに、追加1反応につき3ulを足した量をお送りください。
試料に、Salt, EDTA, protein, carbohydrate, RNA, EtOH, primer dimerなどが残っていると、シーケンシング反応の過程、あるいはキャピラリー内でinhibitorとして作用する場合もありますので、純度の確保には特に留意ください。
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