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シーケンス結果を用いて投稿予定ですが必要な情報を教えてください。
• Sequencing Kit : ABI BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits
• Sequencer : ABI 3730xl Analyzer (96 capillary type)
• PCR machine : BioRad DNA Engine Dyad PTC-220
• Seuencing protocol；
Sequencing reactions were performed in a BioRad DNA Engine Dyad PTC-220 Peltier Thermal Cycler using a ABI PRISM® BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems), following the protocols supplied by the manufacturer. Single-pass sequencing was performed on each template using [uiversial or what you selected]primer. The fluorescent-labeled fragments were purified from the unincorporated terminators with an ethanol precipitation protocol. The samples were resuspended in distilled water and subjected to electrophoresis in an ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems).
解析結果グラフにあるPhred Scoreとは何ですか？
Phredとは、
Base callingプログラムであり、シーケンサが作り出したイメージファイル(ABI, SCF, ESDなど)を読み込み、Fasta formatに変換するプログラムです。グラフイメージ中のchromatogramの曲線を見て適切なBaseを指定するとともにスコアまで作りファイルにし、Fourier Transform Algorithmが使用されます。
Phredから得られたスコアをQV (Quality Value)にて塩基配列の正確さを判定することができるようにQVを割り当てております。 QVを単純に「Phred Score」とも呼ばれます。
QV = -10 * log (P)
Phred Scoreが20の塩基配列のエラー確率は10-2（正確度99％）
Phred Scoreが30の塩基配列のエラー確率は10-3（正確度99.9％）
Phred Scoreが40の塩基配列のエラー確率は10-4（正確度99.99％）
サンプルおよび解析結果の保存期間は？
お送りいただいたサンプルは、弊社到着から1ヶ月間保管いたします。オーダー様式でサンプル保存の【希望しない】を選択された場合には、サービス終了後に処分いたします。
解析データは弊社のサーバーに1ヶ月間保存いたしますので、その間に必ずデータの保存をお願いいたします。
プライマーはどのように準備して送ればいいのでしょうか？
サンプル試料と混合せず、必ず別の1.5mlチューブにご用意ください。
5 pmol/ul に調整した溶液を基本量10ulに、追加1反応につき2ulを足した量をお送りください。弊社にてプライマーの濃度確認が行えないため、プライマーの濃度が正確でない場合、良好な結果が得られない可能性が御座います。必ずプライマーの濃度をご記入くださいますようお願い申し上げます。
シーケンシング用のプライマーはPAGEおよびHPLC精製以上の品質がお勧めですが、OPC精製においても同様の水準のqualityが保障されるのであれば問題ありません。GC contentは40-60％程度、dimer formationおよびhair-pin formationが4bp以上にならないよう、また、end stabilityが高くないようにデザインしてください。50℃(単一条件下)でannealingするため、Tmは50-58℃をお勧めします。
弊社保有のユニバーサルプライマーをご利用の際は、必ずプライマーの配列をご確認の上、ご選択ください。稀なケースですが、いくつかのベクターにて、ベクターマップに該当する配列があるにも関わらず、結合しない場合が御座います。（ex. PET, pCL, pENTR, pDONR etc.）
DNAはどのように準備した方がいいですか？
Plasmid DNA (high copy number) は100-200ng/ul、PCR産物は50-100ng/ul手移動の濃度で1.5mlチューブにご用意ください。ご依頼の反応数に応じて、基本量10ulに、追加1反応につき3ulを足した量をお送りください。
試料に、Salt, EDTA, protein, carbohydrate, RNA, EtOH, primer dimerなどが残っていると、シーケンシング反応の過程、あるいはキャピラリー内でinhibitorとして作用する場合もありますので、純度の確保には特に留意ください。
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